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一种红托竹荪液体菌种快繁方法与流程 
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一种红托竹荪液体菌种快繁方法与流程,贵州鸿富鑫生态农业科技有限公司


本发明涉及农业科技种子生产技术领域,尤其是一种红托竹荪液体菌种快繁方法。


背景技术:


红托竹荪(dictyophorarubroualuata)属担子菌门、腹菌纲、鬼笔科、竹荪属,为臧穆先生于1984年发表的一个新种;同年宣布该菌人工驯化成功。红托竹荪素有“菌中皇后”的美誉,富含丰富的氨基酸、维生素、无机盐等营养成分,对高血压、神经衰弱、肠胃疾病等具有保健作用。还具有特异的防腐功能,夏日加入竹荪烹调的菜、肉多日不变馊。自1972年尼克松访华时,以“芙蓉竹荪汤”从国宴走向世界后,竹荪的身价一直居高不下。其中红托竹荪以淡清香型、久煮不糊的特异品质,为竹荪品种中的精品,单价曾一度堪比黄金。


但30多年来,红托竹荪制种还是停留在固体菌种生产工艺上,即从竹蛋分离母种—母种扩大—原种扩繁—栽培种生产。另外红托竹荪菌丝生长速度缓慢,常规的木屑培养基、常规接种量的红托竹荪栽培种长满瓶(体积500ml)需要半年之久。传统的红托竹荪固体母种到栽培种的生产过程一般要经过大半年的时间才能进行栽种生产,菌种生产周期较长,培养成本较高,短时期不能大量扩繁菌种;期间受温度与光照的波动影响大,菌丝常常发红,极易吐黄水,发生老化,造成同批次接种栽培种的菌龄与活力常常参差不齐,严重影响了红托竹荪的产量和品质。


目前竹荪属中驯化成功且大面积种植的4个品种中,其中长裙竹荪、棘托竹荪、短裙竹荪均有液体菌种的相关研究报道,唯独红托竹荪缺失。本专利采用的接种点萌发快、分两个阶段液体摇瓶;实现了二级液体菌种8天结束摇瓶,其中红托竹荪菌丝球大小均匀,菌丝球密度大、菌丝干重能达16g/l;使红托竹荪菌种的工厂化生产与应用真正成为可能,解决了制种慢与菌种质量差等制约红托竹荪产业发展的技术难题,具有很大的应用和推广价值。


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技术实现要素:


本发明的目的是,提供一种红托竹荪液体菌种快繁方法,实现8天内结束液体摇瓶,产生的红托竹荪菌丝球大小均匀、菌丝球密度大,适宜于工厂化液体发酵。为红托竹荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。


本发明是这样实现的,包含以下步骤:


1)一级液体培养基制做:按葡萄糖10g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸镁0.8g/l、马铃薯380g/l(煮汁过滤)、蛋白胨2.5g/l、酵母粉0.5g/l、vb10.03g/l、琼脂粉1.5g/l的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中,定容后按150ml的量分装于三角瓶中(体积250ml),用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌(121℃、20min)。


2)红托竹荪一级液体菌种制备:75%酒精擦拭长满且吃透料的红托竹荪母种,置于超净工作台中;无菌条件下用耳型镊挑取蚕豆大小的母种5粒转接于冷却好的一级液体培养基中,完成接种后上摇床暗培养(25℃、150r/min)。接种点3天萌动,22天能结束一级液体菌种的摇瓶培养。


3)二级液体培养基制做:葡萄糖25g/l、磷酸二氢钾1g/l、蛋白胨4.5g/l、硫酸铵0.5g/l、马铃薯360g/l(煮汁过滤)、酵母粉3.6g/l、果糖15g/l、羧甲基纤维素8g/l的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中,定容后按150ml的量分装于三角瓶中(体积250ml),用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌(121℃、20min)。


4)红托竹荪二级液体菌种制备:75%酒精表面消毒发酵好的红托竹荪一级液体菌种、二级液体培养基后,置于超净工作台灭菌;用无菌的5ml枪头吸取一级液体菌种转入二级液体培养基中培养(接种量体积比为1:30),完成接种后上摇床暗培养(25℃、150r/min),培养8天即获得二级液体菌种。



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具体实施例。


2017年6-10月,在贵州省农作物品种资源研究所真菌室进行红托竹荪的液体摇瓶培养,具体步骤如下:


1)2017年8月底进行一级液体培养基制做:按葡萄糖10g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸镁0.8g/l、马铃薯380g/l(煮汁过滤)、蛋白胨2.5g/l、酵母粉0.5g/l、vb10.03g/l、琼脂粉1.5g/l的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中,定容后按150ml的量分装于三角瓶中(体积250ml),用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌(121℃、20min)、冷却后备用。


2)2017年9月初进行红托竹荪一级液体菌种制备:75%酒精表面消毒长满且吃透料的红托竹荪母种,然后置于超净工作台中;无菌条件下用耳型镊挑取蚕豆大小的母种5粒转接于冷却好的一级液体培养基中,完成接种后上摇床暗培养(25℃、150r/min)。接种点3天萌动,9月25日结束一级液体菌种的摇瓶培养。


3)2017年9月下旬进行二级液体培养基制做:葡萄糖25g/l、磷酸二氢钾1g/l、蛋白胨4.5g/l、硫酸铵0.5g/l、马铃薯360g/l(煮汁过滤)、酵母粉3.6g/l、果糖15g/l、羧甲基纤维素8g/l的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中,定容后按150ml的量分装于三角瓶中(体积250ml),用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌(121℃、20min)、冷却后备用。


4)2017年10月初进行红托竹荪二级液体菌种制备:75%酒精表面消毒发酵好的红托竹荪一级液体菌种、二级液体培养基后,置于超净工作台灭菌;用无菌的5ml枪头吸取一级液体菌种转入二级液体培养基中培养(接种量体积比为1:30),完成传代后上摇床暗培养(25℃、150r/min),10月9日结束二级液体菌种的摇瓶培养,整个摇瓶培养过程为8天。


5)2017年10月中旬进行红托竹荪二级液体菌种的验证,包括菌种一致性鉴定、菌丝产量等。将发酵好的红托竹荪二级液体菌种接种到pda培养基中、见光25℃培养,同时提取菌丝球的dna进行cdna-its的扩增与genbank比对鉴定;另外抽滤二级液体菌种后,40℃干燥、利用恒重法测定菌丝产量。结果表明:二级液体菌种转接到pda培养基中,3天后开始萌动、半个月后菌丝发红,这符合红托竹荪见光培养的特征;同时genbank中的cdna-its比对的鉴定也为红托竹荪生物种;40℃恒重干燥法得到红托竹荪二级液体菌种菌丝球为16.4g/l。


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技术特征:


技术总结

本发明公开了一种红托竹荪液体菌种快繁方法,该方法接种点萌发快,分两个阶段液体摇瓶;二级液体菌种8天结束摇瓶,其中红托竹荪菌丝球大小均匀,菌丝球密度大、菌丝干重能达16g/L。同时产生的红托竹荪液体菌种适宜作为工厂化发酵的液体种子,液体摇瓶培养参数能为红托竹荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。


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